Em 1550, a casa de despacho da Misericórdia do Porto na rua das Flores estava operacional e a igreja, no seu lado sul, seria benzida em 1559 pelo bispo do Porto D. Rodrigo Pinheiro. Nesse mesmo ano, indica-se que o mestre da obra era Manuel Luís.
A bênção da igreja, porém, não significou que ela estivesse concluída. Só em 1564, a abóbada de berço com caixotões de granito que cobria a nave foi terminada. Contudo, os acabamentos prolongaram-se até 1568.
No frontispício, recuado em relação à frente da casa de despacho, a igreja exibia um pórtico coríntio.
A capela-mor, todavia, só se construirá entre 1584 e 1590. O mesmo mestre Manuel Luís foi o seu projetista, com um plano semelhante ao da capela-mor da igreja do Mosteiro dos Jerónimos em Lisboa, embora numa escala mais reduzida e com uma maior presença do ornato flamengo do arquiteto Vredeman de Vries.
No século XVIII, devido a problemas estruturais, em boa parte causados pela elevada concentração de humidades, foi necessária uma intervenção profunda na igreja (1748-54).
Esta seria protagonizada pelo pintor-arquiteto Nicolau Nasoni, que desenhou a atual fachada barroca, e pelo engenheiro Manuel Alves Martins, que produziu as plantas para o novo coro e corpo da igreja.
Em 1866-67, ocorreu uma nova campanha de obras. Os azulejos primitivos, que tinham sido colocados entre 1629-1639, foram substituídos por azulejos azuis e brancos.
Na mesma altura, os painéis do retábulo-mor, de onde foram retiradas as restantes três pinturas de Diogo Teixeira, foram revestidos por azulejos relevados da Fábrica Carvalhinho. No local originalmente ocupado pelo sacrário e pelo painel central do segundo nível foi, na mesma campanha de obras, colocado um retábulo ao gosto neoclássico.
